Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan Go Taq Green

PCR (Polymerase Chain Reaction) didefinisikan sebagai suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintetis molekul DNA baru yang komplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu alat yang disebut thermocycler (Muladno, 2002). Campbell et al., (2008) menyebutkan bahwa PCR merupakan metode hibridisasi DNA dengan prinsip seperti “mesin fotokopi” yang hanya menyalin DNA target secara spesifik.

Prinsip kerja mesin PCR pada dasarnya adalah menggunakan “siklus berlangkah tiga”, yang memiliki arti tiga tahapan penting dalam reaksinya; denaturation, annealing dan extension (Campbell et al., 2008). Pada setiap siklus, campuran reaksi dipanaskan untuk mendenaturasi untaian-untaian DNA kemudian didinginkan agar terjadi penempelan (annealing, pembentukan ikatan Hidrogen) primer DNA pendek beruntai tunggal yang komplementer dengan sekuens-sekuens di untai yang satu lagi pada setiap ujung sekuens DNA target. Setelah terjadi penempelan primer DNA, maka terjadi pemanjangan DNA target (extension). DNA polymerase bersifat tahan panas, dan akan memperpanjang primer-primer dengan arah 5’ ke 3’. Tahapan denaturation, annealing dan extension akan membentuk suatu siklus yang yang berlanjut sesuai dengan jumlah DNA target yang diinginkan. Bersamaan dengan itu, terbentuk pula molekul DNA baru secara in vitro dalam mesin PCR (Campbell et al., (2008); Muladno, (2002)).

Berdasarkan kisaran suhu dalam proses PCR, Muladno (2002) meyatakan bahwa proses denaturasi umumnya berlangsung 95⁰C dimana pada suhu ini untai ganda DNA akan terbuka, suhu annealing umumnya adalah 36⁰C sampai 72⁰C dan extension menggunakan suhu 72⁰C. Proses PCR memerlukan komponen penting yakni: DNA target, primer, enzim Taq DNA polymerase, deoxinucleoside triphospat (dNTP) dan larutan buffer (Muladno, 2002).

Hal yang mengesankan dari kecepatan PCR adalah spesifitasnya. Campbell (2008) menyebutkan bahwa PCR dapat mengamplifikasi DNA dalam jumlah yang sedikit, dan bahkan walaupun telah terdegradasi sebagian. Salah satu kunci utama spesifitas DNA adalah primer, yang berikatan hydrogen hanya dengan sekuens-sekuens di ujung-ujung yang berlawanan dari segmen DNA target. Berkaitan dengan panjang primer, Muladno (2002) menyatakan bahwa primer oligonukleotida harus berkisar antara 16-24 basa, semakin panjang primer maka tingkat spesifitasnya semakin tinggi. Campbell et al., (2008) menyebutkan bahwa primer minimal yang harus digunakan adalah 15 basa. Penentuan primer harus diuji terlebih dahulu dari konsentrasi rendah hingga konsentrasi tinggi, karena primer memiliki kadar optimalitas yang berbeda-beda bergantung jenis DNA organisme maupun produk primer yang digunakan (Yowono, 2005).

PCR yang dirancang pada tahun 1985, berkembang pesat dimasa kini dan telah berdampak terhadap penelitian biologi dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk mengamplifikasi DNA dari berbagai macam sumber, seperti fosil, olah TKP, sel-sel embrio tunggal untuk mendiagnosis penyakit menular/turunan, amplifikasi gen-gen virus dari sel terinveksi virus yang sukar dideteksi misalnya HIV, ebola dan lain-lain (Campbell et al., 2008)

Setelah tahap PCR selesai, maka selanjutnya dilakukan visualisasi untuk mengkonfirmasi apakah DNA tersebut berhasil di amplifikasi ataukah tidak. Tekik yang digunakan adalah dengan elektroforesis gel agarosa atau gel ploakliramida. Yowono (2005) menyatakan bahwa elektroforesis adalah suatu teknik untuk memisahkan molekul seluler berdasarkan pada ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium mengandung sampel DNA yang akan dipisahkan.

Prinsip dasar dari elektroforesis adalah perbedaan muatan akan mempengaruhi makromolekul (DNA, RNA ataupun protein) dalam gel sehingga terjadi proses mobilisasi makromolekul dari muatan negatif ke positif. Molekul DNA hasil PCR yang dielektroforesis bermuatan negatif, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul DNA tersebut akan bergerak dari kutub negatif (anoda) ke kutub positif (katoda). Kecepatan gerak molekul DNA bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Yuwono, 2005).

Campbell et al., (2008) menambahkan bahwa, perbedaan ukuran, muatan dan sifat-sifat fisik DNA mempengaruhi laju pergerakan DNA pada gel. Jarak yang ditempuh oleh molekul DNA berbanding terbalik dengan panjangnya. DNA rekombinan maupun hasil amplifikasi PCR dipisahkan menjadi pita-pita DNA yang dapat berpendar dibawah UV transluminator. Untuk elektroforesis hasil PCR pita-pita yang dihasilkan mempunyai panjang yang sama jika primer yang digunakan adalah identik (Yuwono, 2005). Berdasarkan teori singkat yang telah disebutkan, maka perlu praktikum tentang PCR dan elektroforesis DNA hasil PCR, karena pada dasarnya uraian diatas sangatlah abstrak dan sulit untuk dibayangkan jika tidak dipraktekkan.

Cara Kerja

Kegiatan praktikum dilaksanakan pada hari Kamis, 1 Desember 2016. Dimulai pukul 10.20 hingga 12.00 WIT, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Universitas Papua. Perlu diketahui bahwa kegiatan praktikum acara 2, 3, 4 & 5 dilakukan secara menyeluruh, tetapi pembuatan laporan diselaraskan dengan topik praktikum.

Kegiatan praktikum menggunakan alat dan bahan seperti pada penuntun praktikum. Alat dan bahan yang digunakan untuk praktikum PCR adalah:

Pipet mikro	Hasil DNA amplifikasi PCR
Rak tabung	Moleculer grade water
Tips	PCR buffer
PCR strip tube	dNTP’s
Spiner	MgCl2
Thermocycler	Primer (jgHCO & jgLCO)
Tabung eppendorff	Enzyme taq polymerase

1.Mengisi form PCR dan menghitung jumlah raegen yang dibutuhkan.

2.Melakukan pelabelan pada tabung. Label ditulis dengan bolpoin di bagian atas tube.

3.Menyiapkan tabung 0.75 mL untuk pembuatan mastermix.

4.Membuat mastermix sesuai dengan form PCR. Mastermix dan profil mesin dapat dilihat pada tabel berikut.

  

Mastermix	N=1	N=2
ddH2O	18 µL	36 µL
jgHCO	2.5 ng	5 ng
jgLCO	2.5 ng	5 ng
Go taq green	25 µL	50 µL
DNA hasil ekstraksi	2 µL	2 µL

Ket: Go Taq Green tersusun dari; buffer, MgCl₂, dNTP’s, enzim taq polymerase dan loading dye (pemberat). N=2, karena jumlah sampel yang digunakan adalah 2.

Selain informasi mengenai primer yang digunakan, juga ditampilkan informasi mengenai profil mesin PCR beserta suhunya pada tabel berikut:

Tabel 2. Profil mesin PCR beserta suhu dan waktu

Suhu	Waktu
800 C	10 detik
940 C	3 menit
940 C	30 detik
500 C	30 detik            35 x
720 C	45 detik
720 C	15 menit
240 C	1 menit

35 x menyatakan siklus yang dilakukan oleh mesin.

5.Setelah mastermix selesai dibuat, selanjutnya mengambil 2 µL DNA hasil ekstraksi dan dicampur dengan mastermix.

6.Tahap terakhir yakni melakukan spin/centrifuge selama 10 detik dan dimasukkan kedalam thermocycler (mesin PCR), menjalankan program.

 

Tweet

Subscribe to receive free email updates: