Metode Isolasi DNA dengan Geneaid (Tissue)

Tahap awal untuk mempelajari biologi molekuler adalah teknik isolasi dan ekstraksi DNA. Tahap isolasi dan ekstraksi DNA dapat disebut tahap yang paling riskan dalam penelitian biologi molekuler, dimana pengerjaanya harus dilakukan secara aseptik dan steril.

Secara umum tahapan isolasi DNA didefinisikan sebagai suatu tahap mengisolir materi genetik organisme (DNA) sehingga didapatkan materi DNA yang utuh (tanpa kontaminasi) untuk pengujian selanjutnya. Definisi DNA yang utuh artinya bahwa DNA tersebut terbebas dari kontaminan makromolekul lain seperti; karbohidrat, lemak, protein maupun RNA. Tahap isolasi DNA sering disebut dengan pengekstrakan DNA, dimana tahap paling awal dari proses isolasi adalah melakukan ekstraksi pada bagian sampel organisme.

Model isolasi DNA untuk setiap organisme adalah berbeda-beda. Pemilihan metode untuk mengisolasi DNA juga berbeda, bergantung pada organisme yang akan diisolasi DNA-nya. Proses isolasi DNA menggunakan beberapa teknik, misalnya penggunaan fenol-kloroform, pendinginan, penggunaan chelex (resin pengkelet), kromatografi maupun penggunaan kit komersial seperti Promega, Qiagen, Geneaid, invitrogen dan lain-lain.

Meskipun teknik dalam mengisolasi DNA untuk setiap organisme berbeda, pada dasarnya tahap isolasi DNA dibagi menjadi 3 yakni; penghancuran sel, diferensiasi DNA (pemisahan DNA) dan pemurnian DNA. Tahap penghancuran dapat dibagi menjadi tiga model penghancuran, yakni; secara mekanis (penggerusan) hal ini sering dilakukan pada saat ekstraksi DNA tumbuhan, misalnya Milligan (1992) merekomendasikan penggerusan saat ekstraksi DNA tumbuhan sehingga diperoleh ekstrak yang murni. Selain itu, Surzycki (2000) menyatakan bahwa proses vortex dan centrifuge juga dapat menghancurkan sel dari jaringan organisme. Selain cara mekanis, penghancuran sel dapat dilakukan secara enzimatis dan kimia. Secara enzimatis umumnya menggunakan enzim penghidrolisis makromolekul seperti lipase, proteinase, maupun lisozim (amylase, lactase, dll). Penghancuran sel secara kimiawi identik dengan penggunaan bahan kimia seperti SDS, detergen, CTAB, EDTA dll. CTAB & EDTA sering digunakan dalam ekstraksi jaringan tumbuhan (Restu dkk., 2012). Uji kuantitas dan kualitas DNA yang dihasilkan dari masing-masing metode juga telah dilakukan.

Selain penghancuran, proses isolasi DNA diperlukan pemisahan (diferensiasi). Proses ini menggunakan alat yang disebut centrifuge, alat ini mampu memisahkan makromolekul berdasarkan beratnya, dimana protein, lemak dan karbohidrat akan berada dibawah (sedimen) dan DNA beserta RNA akan berada diatas (supernatant). Setelah dipisahkan hasil DNA yang didapat dimurnikan pemurnian DNA dapat dilakukan dengan cara kromatografi kolom atau dengan presipitasi. Pada tahap pemurnian sering ditambahkan RNAse untuk menghancurkan RNA yang tercampur dengan DNA.

Setelah proses isolasi DNA didapatkan ekstrak DNA Cherax sp. murni, maka langkah selanjutnya adalah melihat kualitas DNA hasil ekstraksi. Kualitas hasil ekstraksi dapat dilihat dengan metode elektroforesis. Yowono (2005) menyatakan bahwa elektroforesis adalah suatu teknik untuk memisahkan molekul seluler berdasarkan pada ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium mengandung sampel DNA yang akan dipisahkan.

Prinsip dasar dari elektroforesis DNA adalah DNA akan berpindah dari muatan negatif ke positif dengan laju mobilisasi yang berbeda didasarkan atas perbedaan muatan dan berat molekul.  Molekul DNA genom yang dielektroforesis bermuatan negatif, hal ini dikarenakan gugus fosfat yang memiliki muatan negatif sebagai backbone berpengaruh kuat terhadap basa nitrogen dan gula pentosa (Campbell et al., 2008). Ketika dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul DNA tersebut akan bergerak dari kutub negatif (anoda) ke kutub positif (katoda). Kecepatan gerak molekul DNA bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Yuwono, 2005).  

Muladno (2002) menyatakan bahwa metode mendeteksi kualitas DNA dapat dilihat pada bentuk pita-pita DNA yang terbentuk akibat proses elektroforesis gel, hal ini ditandai dengan terang atau buram-nya pita yang terbentuk pada proses elektroforesis. Berpendarnya pita DNA disebabkan karena pewarnaan dengan larutan etidium bromide yang melekat diantara basa-basa nitrogen. Selain itu penambahan buffer seperti SB buffer memungkinkan DNA akan tetap tahan jika dialiri listrik dengan tegangan tinggi (200 volt). Selain elektroforesis teknik analisis lain dalam biologi molekuler yang telah berkembang misalnya; Southern Blotting untuk deteksi DNA & Northen Blotting untuk protein (Yuwono, 2005)

Pada praktikum ini akan diisolasi DNA yang berasal dari Cherax sp. sejenis lobster air tawar. Sampel jaringan diambil dari bagian ekor dan menggunakan metode seperti yang dijelaskan berikutnya. Hasil yang didapatkan berupa ekatrak DNA yang divisualisasi dengan gel elektroforesis.

Cara Kerja

Kegiatan praktikum dilaksanakan pada hari Selasa, 29 November 2016. Dimulai pukul 08.00 hingga 10.20 WIT, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Universitas Papua. Perlu diketahui bahwa kegiatan praktikum acara 2, 3, 4 & 5 dilakukan secara menyeluruh, tetapi pembuatan laporan diselaraskan dengan topik praktikum.

Kegiatan praktikum menggunakan alat dan bahan seperti pada penuntun praktikum. Praktikum isolasi DNA genom hewan (Cherax sp.) menggunakan alat dan bahan sebagai berikut:

Pinset	Korek
Lampu Bunsen	Vortex
Rak tabung	Heat block
Tube/tabung	Alkohol 70 %
Gelas Piala	Baycline/Bleach
Spin (Centrifuge)	Geneaid isolation KIT tissue
Tissu	Ethanol

Prosedur praktikum isolasi DNA genom hewan (Cherax sp.) dilakukan seperti halnya di penuntun praktikum dan ditampilkan kembali secara singkat dalam poin-poin berikut:

1. Membersihkan area kerja dengan menggunakan alcohol 70% , hal ini berfungsi untuk membunuh mikroba/bakteri di area kerja; dan dilanjutkan dengan bleach/baycline 10% yang berfungsi untuk mengahancurkan DNA mikroba/kontaminan yang ada di area kerja.
2. Menyiapkan tabung eppendorf (microtube) 1.5 mL dan melabeli bagian tutupnya (CRX1 dan CRX2).
3. Menyiapkan pinset, gunting, etanol 96% dalam gelas piala, Bunsen dan korek.
4. Mensterilkan pinset dan gunting yang akan digunakan untuk mengambil jaringan hewan dengan cara menyelupkan kedalam etanol 96% dan dibakar diatas lampu Bunsen (3-5 kali).
5. Mengambil jaringan hewan (Cherax sp.) dengan menggunakan pinset dan gunting yang steril, sampel diambil sedikit mungkin dan dimasukkan ke dalam microtube yang telah dilabeli.
6. Menambahkan 200 µL GT buffer, menghaluskan dengan mikropastel.
7. Menambahkan 20 µL Proteinase K dan di-vortex selama 10 detik agar tercampur rata, kemudian di spin 20 detik. Penambahan Proteinase K berfungsi agar protein yang ada dalam jaringan tersebut hancur sehingga tidak mengkontaminasi DNA hasil isolasi.
8. Memanaskan sampel pada suhu 60⁰ C selama 30 menit.
9. Menambahkan 200 µL GBT buffer dan menginkubasi pada suhu 70⁰ C selama 20 menit.
10. Melakukan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 2 menit.
11. Mengambil supernatant dan memindahkan pada tabung (microtube) yang baru, dilanjutkan dengan penambahan 200 µL etanol 96% dan di-vortex selama 10 detik.
12. Memanaskan elotion buffer pada suhu 70⁰ C sampai nanti akan digunakan.
13. Menyiapkan GD kolom dalam tube 2 mL dan memberi label pada bagian tutupnya. GD kolom berfungsi untuk kromatografi DNA.
14. Mentransfer campuran supernatant dan etanol (langkah k) ke dalam GD kolom dan melakukan sentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 30 detik.
15. Membuang larutan pada bagian bawah dan menempatkan GD kolom dalam tube 2 mL tersebut.
16. Menambahkan 400 µL W1 buffer ke dalam GD kolom dan sentrifugasi pada 15.000 rpm selama 30 detik, selanjutnya membuang larutan bagian bawahnya dan menempatkan kembali GD kolom pada tabung 2 mL.
17. Menambahkan 600 µL Wash buffer dan sentrifugasi pada 15.000 rpm selama 30 detik, selanjutnya  membuang larutan dibawahnya. Mengeringkan kolom dengan cara sentrifugasi pada 15.000 rpm selama 3 menit.
18. Memindahkan GD kolom pada tabung 1.5 mL yang baru dan menambahkan elution buffer yang telah dipanaskan tadi.
19. Mendiamkan selama 3-5 menit dan sentrifugasi pada 15.000 rpm selama 30 detik.
20. Membuang GD kolom dan menyimpan larutan hasil ekstraksi DNA ke dalam freezer.

Tweet

Subscribe to receive free email updates: